MRSA برای اولین بار در اواخر سال 1970 به عنوان یک پاتوژن جدی برای انسان پدیدار شد (لونارد و مارکی، 2008).
سویههای MRSA از حیوانات به خصوص از گاوهای مبتلا به ورم پستان، اسب و سگها همراه با ایجاد ضایعات استافیلوکوکس جدا شده است (جانوسی و همکاران، 2007). در سال 1972، MRSA در شیر گاوهای مبتلا به ورم پستان در بلژیک یافت شد. از لحاظ تاریخی، عفونتهای MRSA در حیوانات همزمان با سویههای درگیر شبیه به سویههای بیمارستانی انسان از جمله بیماری همه گیر 44(EMRSA) MRSA است (مورگان، 2008). در سالهای اخیر MRSA به طور فزایندهای به عنوان یک مشکل در دامپزشکی گزارش شده است به خصوص در کسانی که با حیوانات کوچک و اسب سرو کار دارند (لونارد و مارکی، 2008).
هنگامی که اپیدمی HA-MRSA45 در سگ مشاهده شد (مورگان، 2008)، فرض بر این بود که جهت گسترش بیماری از انسان به حیوانات بوده است، با این حال، این وضعیت، با گونههایی از MRSA که در حیوانات وجود دارند و به انسان منتقل میشوند، به سرعت در حال تغییر است (مورگان، 2008؛ ون بلکوم ای و همکاران، 2009).
درحالی که استافیلوکوکوس آرئوس محدود به بیمارستان میشد اخیرا MRSA به سرعت در حال شیوع در جامعه است (کانافانی و فولر، 2006؛ لونارد و مارکی، 2008). عفونتهای MRSA در سال1995، 22 درصد از عفونتهای استافیلوکوکی گزارش شده است در حالی که این رقم در سال 2004 به 63 درصد افزایش یافته است (مقدمی و همکاران، 2010).
در سال 1990،MRSA به یکی ار علل ایجاد کنندهی عفونتهای بیمارستانی تبدیل شده است (کوک، 1998)، این مسئله به دلیل افزایش شیوع مشکلات درمانی جدی و کنترل عفونت در محیط بیمارستان است.
سویههای MRSA به آنتیبیوتیکهای بتا-لاکتام مقاوم هستند، که این مقاومت اغلب وابسته به ژن mecA است. این ژن یک پروتئین متصل شونده به پنیسیلین (PBP2α) را کد میکند که در دیواره سلولی باکتریها بیان میشود (لونارد و مارکی، 2008؛ پانتوستی وندیتی، 2009) و مسئول ساخت وساز و تعمیر و نگه داری آن میباشد، همچنین این ژن با اعمال ژن پنیسیلیناز ممانعت میکند (پانتوستی و وندیتی، 2009). این ژن تمایل کمی به آنتیبیوتیکهای بتا-لاکتام دارد (لونارد و مارکی، 2008). PBP2α توسط متیسیلین مسدود نمیشود و میتواند جایگزین PBP دیگر شود، در نتیجه باعث بقای این باکتری در حضور متیسیلین میشود (پانتوستی و وندیتی، 2009). ژن mecA روی کروموزوم، در یک عنصر ژنتیکی به نامS. Chromosome Cassette mec (SCC mec) جا سازی شده است (پانتوستی و وندیتی، 2009؛ هیراماتسو و همکاران، 2001). بنابراین این گروه از آنتیبیوتیکها در برابر باکتریهایی که این ژن را بیان میکنند بی اثر هستند (لونارد و مارکی، 2008). حضور PBP2α به تنهایی به معنی MRSA نیست بلکه به معنی مقاومت در برابر تمامی آنتیبیوتیکهای بتا-لاکتام از جمله پنی سیلینها، سفالوسپورینها و کرباپنمهای مصنوعی است (پانتوستی و وندیتی، 2009). بیشتر MRSA های جدا شده به تعداد زیادی از گروههای دیگر آنتیبیوتیکی نیز مقاوم هستند (مارکی و لونارد، 2008؛ کانافانی و فولر، 2006). شواهدی وجود دارد که سویههای حساس به متیسیلین (MSSA) به متیسیلین از طریق دستیابی به عنصر SCC mec مقاوم شدهاند (مارکی و لونارد، 2008). احتمالا این موارد در سویههای استافیلوکوکوس آرئوس کواگولاز منفی رخ میدهد (مارکی و لونارد، 2008؛ رحیمی و همکاران، 2009).
8-2- اپیدمیولوژی MRSA در انسان
در انسان MRSA در مجراهای قدامی بینی به صورت فلور وجود دارد (کلویتمن و همکاران، 1997). از دیگر جاهایی که این عامل وجود دارد گلو، زیر بغل و کشالهی ران میباشد (لونارد و مارکی، 2008).
کلونیزه شدن این ارگانیسم در حفره بینی منجر به انتشار آن در سایر بخشها میشود. پرسنل بیمارستان نسبت به سایر افراد بیشتر مبتلا میشوند، این پرسنل میتوانند به عنوان مخزن برای MRSA و انتقال آن به سایرین عمل کنند. کلونیزه شدن عامل میتواند به صورت گذرا و یا مداوم باشد (کلویتمن و همکاران، 1997). بیشتر از 60 درصد افراد ناقل متناوب این ارگانیسم هستند در حالی که 20 درصد افراد ناقل مداوم یک گونهی منفرد آن هستند. میزان حامل بودن با توجه به جمعیت مورد مطالعه متفاوت است، به عنوان مثال در کودکان بیشتر از بالغین است. در بررسی جامع نظر سنجی منتشر شدهی مقطعی کلویتمن و همکاران (1997) گزارش شده که میانگین نرخ انتقال2/37 درصد است. در بررسیهای اخیر آمریکا از مردم، میزان شیوعاستافیلوکوکوس آرئوس، 6/31 درصد گزارش شده است. شیوع کلونیزه شدن MRSA، در مطالعهی لونارد ومارکی (2008)، 84/0 درصد گزارش شده است (لونارد و مارکی، 2008).
فاکتورهایی که باعث افزایش خطر ابتلا به عفونتهای MRSA میشود شامل:
– درمان طولانی مدت با آنتیبیوتیکها
– جراحی
– بستری شدن طولانی در بیمارستانها
– درمان در بخش مراقبتهای ویژه
– نزدیکی به سایر بیماران آلوده
است (صادری و همکاران، 2009؛ لونارد و مارکی، 2008). استافیلوکوکوس آرئوسهایی که در بینی هستند اغلب در پوست کلونیزه میشوند و معمولا توسط دست انتقال مییابند (لونارد و مارکی، 2008).
9-2- بیماریهای استافیلوکوکی در انسان
استافیلوکوکوس آرئوس به عنوان یک پاتوژن در طب انسانی و حیوانی شناخته شده است (مارکی و لونارد، 2008) که میتواند طیف گستردهای از عفونتها در انسان و حیوانات، از عفونتهای خفیف پوستی تا عفونتهای تهدید آمیز حیات از قبیل باکتریمی46، اندوکاردیت و ذات الریه را ایجاد کند. به طور عمده نوعی از مسمومیت غذایی توسط این باکتری به وسیلهی یک انتروکسین مقاوم به حرارت ایجاد میشود (لونارد و مارکی، 2008؛ کانافانی و فولر، 2006). در میان پاتوژنهای ایجاد کنندهی بیماریهای عفونی به خصوص MRSA از علل مهم بیماریهای عفونی انسان است.
1-9-2- باکتریمی و اندوکاردیت
گاهی بعد از عفونتهای سیستم تنفسی باکتریها وارد گردش خون شده و در سطح لایه داخلی قلب قرار میگیرند. اغلب این عفونتها در مبتلایان به دیابت، بیماریهای قلبی- عروقی و در موارد نقص ایمنی دیده میشود. اندوکاردیت استافیلوکوکی مرگ و میر بالایی در حدود 80-40 درصد دارد (موری و همکاران، 2009).
2-9-2- عفونتهای پوست و بافت نرم
استافیلوکوکها بر روی پوست و غشاهای مخاطی پستانداران و پرندگان بصورت ساپروفیت اقامت دارند. استافیلوکوکوس آرئوس علت اصلی عفونتهای پوست و بافت نرم در بیشتر کشورهای جهان میباشد. اما خوشبختانه این عفونتها خیلی جدی نیستند. این عفونتها دامنه وسیعی دارند، از فولیکولیت47 و دمل48 گرفته تا التهاب سلولی49 و آبسههای عمیق مشاهده میشود (گولد و همکاران، 2009).
3-9-2- استئومیلیت50 و آرتریت51
استافیلوکوکوس آرئوس شایعترین علت استئومیلیت میباشد. این عفونت به دو شکل اولیه و ثانویه ایجاد میشود. در شکل اولیه باکتریها از طریق گردش خون وارد دیافیز استخوانهای دراز میشوند. اما در شکل ثانویه، باکتریها پس از پارگی پوست یا شکستگی باز در بافت استخوان نفوذ میکنند (وین و همکاران، 2006). آرتریت چرکی یا پیلوآرتریت52 بعد از جراحیهای مفصل، عفونتهای استخوان یا متعاقب تزریق داخل مفصلی بروز میکند. استافیلوکوکوس آرئوس عامل تقریبا نیمی از موارد آرتریت چرکی است (موری و همکاران، 2009).
4-9-2-ذات الریه
استافیلوکوکوس آرئوس یک علت مشخص بیماریهای سیستم تنفسی میباشد. عفونت ریوی ناشی از استافیلوکوکوس آرئوس ممکن است از طریق استنشاق یا از طریق ورود گردش خون از مکان دیگری ایجاد شود (وین و همکاران، 2006).
5-9-2- عفونتهای سیتم ادراری
استافیلوکوکها علت رایج عفونتهای سیستم ادراری نیستند. استافیلوکوکوس آرئوس ممکن است باعث عفونت سیستم ادراری شود. گستردگی این عفونتها شامل باکتریوری53 تا موارد شدید باکترمی میباشد (موری و همکاران، 2006).
6-9-2- سندروم شوک سمی54
عامل این بیماری سویههایی از استافیلوکوکوس آرئوس هستند که توکسین شوک سمی را تولید میکنند. علائم بالینی این سندروم شامل تب بالا، کاهش فشار خون، اسهال و درد عضلانی میباشد (موری و همکاران، 2009).
10-2- اپیدمیولوژی MRSA در حیوانات
با توجه به اهمیت استافیلوکوکوس آرئوس به عنوان یک عامل ورم پستان در گاو و استفادهی گسترده از آنتیبیوتیکهای داخل پستانی، شاید تعجب آور نباشد که گفته شده که اولین MRSA جدا شده از حیوانات از گاوهای شیری و مبتلا به ورم پستان بوده است (لونارد و مارکی، 2008). از آن زمان به بعد MRSA در گونههای مختلف دیگر از جمله سگ پیدا شد (لونارد و مارکی، 2008؛ جانوسی، 2007)، گزارشات دیگری مبنی برظهور ناگهانی عفونت در گربه، اسب، گوسفند، خوک و جوجه وجود دارد. یک نظر سنجی اخیر نشان داد که استافیلوکوکوس آرئوسهای جدا شده از بیماران در هفت بیمارستان دامپزشکی، 14 درصد از بیماران مبتلا به MRSA بودند و این عفونت در میان سگ و اسب شایع بود (لونارد و مارکی، 2008).
11-2- بیماریهای استافیلوکوکی در حیوانات
عفونتهای MRSA در حیوانات عمدتا در پوست و بافت نرم ایجاد میشوند (مورگان، 2008). استافیلوکوکوس آرئوس یکی از رایجترین علل ورم پستان گاو و دیگر بیماریهای شدید حیوانی مانند عفونت زخم، سپتی سمی و عفونت استخوان و مفاصل شناخته شده است (جانوسی، 2007).
1-11-2- ورم پستان
استافیلوکوکوس آرئوس یکی از مهمترین باکتریهای عامل ورم پستان در گاو است. کنترل آن مشکل است و همه انواع سلولهای التهابی در غده مبتلا دیده میشود. ورم پستان ناشی از استافیلوکوکوس آرئوسعمدتا تحت بالینی و مزمن است و معمولا پاسخ ضعیفی به درمانهای رایج میدهد. محل اولیه زندگی و منبع اصلی این باکتری غده پستانی آلوده است و در حین دوشش شیر منتقل میشود (کریم و همکاران، 1380). وجود این باکتری با تعداد بالای سلولهای سوماتیک همراه است (ریچارد و همکاران، 2006). باکتری بصورت متناوب و به تعداد خیلی کم از پستانهای آلوده دفع میشود، بنابراین تعداد آن در شیر مخزن بسیار اندک بوده و جداسازی آن آسان نیست (محبی، 1390). بهرحال تشخیص این میکروارگانیسم در شیر مخزن بیانگر حضور دامهای مبتلا در گله میباشد (پینگ و همکاران، 2006).
12-2- انتقال
شکل اولیه انتقال MRSA به صورت انتقال مسقیم از شخص به شخص و از طریق تماس دستی است. این باکتری از طریق لوازم بهداشتی شخصی از قبیل حوله و یا تیغ که با عفونت پوستی تماس داشته میتواند منتقل شود. هم چنین تماسهای سطحی از جمله استفاده از بانداژهای آلوده شده با MRSA و یا افرادی که ذات الریه MRSA دارند میتوانند از طریق سرفه کردن عفونت را منتقل کنند. افرادی که در بیمارستانها کار میکنند سرعت جایگزینی بالاتری نسبت به افراد عادی دارند. انتقال MRSA بین انسان و حیوانات (سگ، اسب، خوک) گزارش شده است (لونارد و مارکی، 2008؛ مورگان، 2008).
13-2-تشخیص ازمایشگاهی
جهت تشخیص استافیلوکوکوس آرئوس به طور معمول از دو روش سنتی که شامل روشهای کشت و تستهای بیوشیمیایی است و روشهای مولکولی از جمله PCR استفاده میشود.
1-13-2- نمونه گیری
چرک، خون، ترشحات سیستم تنفسی و مایع مغزی نخاعی همگی نمونههای مناسبی برای انجام آزمایشات تشخیصی میباشند (بروکس و همکاران، 2010).
2-13-2- روش میکروسکوپی مستقیم
پس از تهیه گسترش از نمونههای کلینیکی در زیر میکروسکوپ کوکوسهای گرم مثبت به شکل خوشههای نامنظم شبیه انگور در اندازه 5/0 تا 5/1 میکرومتر مشاهده میشوند. باکتریها ممکن است بصورت منفرد، جفتی، زنجیره کوتاه یا خوشهای مشاهده شوند (بروکس و همکاران، 2010).
3-13-2- کشت و جداسازی باکتری
نمونههای کلینیکی باید بر روی محیط آگار خوندار55 و سایر محیطهای کشت تلقیح شوند. مانیتول سالت آگار56 نیز یک محیط انتخابی مناسب برای تایید حضور استافیلوکوکوس آرئوس میباشد. در محیط آگار خوندار حاوی خون گوسفند استافیلوکوکها طی 24 ساعت رشد میکنند. بعضی از گونههای استافیلوکوک ممکن است به گرم خانهگذاری بیشتر از 24 ساعت تا 48 ساعت نیاز داشته باشند (وین و همکاران، 2006).
4-13-2- مشخصات کلنی
کلنیهای این باکتری در محیط آگار مغذی57 بصورت صاف، کروی، سفید رنگ، مات و با 3-1 میلی متر ظاهر میشوند (طباطبایی و فیروزی، 1380; کوین و همکاران، 1994). تولید رنگدانه زرد طلایی ناشی از وجود کاروتنوئید58 در استافیلوکوکوس آرئوس معمول است (طباطبایی و فیروزی، 1380). در محیط آگار خوندار شکل ظاهری کلنی مثل محیط آگار مغذی میباشد ولی ممکن است در اطراف کلنی بعضی از سویهها هاله همولیز مشاهده شود (طباطبایی و فیروزی، 1380). استافیلوکوکها دارای 4 نوع همولیزین آلفا، بتا، گاما و دلتا هستند. همولیزین آلفا بلافاصله باعث تشکیل هالهای نازک از همولیز کامل در اطراف کلنی میگردد. در صورتیکه همولیزین بتا با تشکیل هالهای پهنتر باعث ایجاد همولیز ناقص میگردد. در صورت وجود هر دو نوع همولیزین در اطراف کلنی هالهای مضاعف مشاهده میشود (کوین و همکاران، 2011). همولیزین بتا یک همولیزین گرم – سرد59 است که به وسیلهی 20-10% از سویههای استافیلوکوکوس آرئوس جدا شده از انسان تولید میشود. این توکسین یک اسفنگومیلیناز است که باعث لیز اریتروسیتها (شامل اریتروسیتهای انسان) میشود. این توکسین وقتی که در دمای 37 درجه سانتیگراد گرمخانهگذاری میشود و سپس به دمای سرد انتقال داده میشود، باعث لیز اریتروسیتها میگردد (بهادر و همکاران، 1390).
5-13-2- تستهای مورد نیاز برای بررسی بیماریزایی60 استافیلوکوکها
1- تست کواگولاز
استافیلوکوکوس آرئوس آنزیم کواگولاز تولید میکند. دقیقترین آزمایشی که برای بازشناسی استافیلوکوکوس آرئوس در آزمایشگاههای میکروبیولوژی به کار میرود، آزمایش کواگولاز میباشد. اگرچه تعداد کمی از سویههای استافیلوکوکوس آرئوس نمیتوانند مقدار مشخصی از کواگولاز را تولید کنند اما بنظر میرسد همه سویهها ژن کواگولاز را داشته باشند (واندنش و همکاران، 1994).
کواگولاز فاکتور نشاندهنده قدرت تهاجمی باکتری میباشد و استافیلوکوکوس آرئوس کواگولاز مثبت را از سایر گونههای استافیلوکوکوس کواگولاز منفی مجزا مینماید. نقش کواگولاز در بیماریزایی مورد بحث میباشد ولی کواگولاز ممکن است موجب تشکیل لایه فیبرین در اطراف آبسه استافیلوکوکی شود، بنابراین سبب موضعی نمودن عفونت و محافظت در برابر فاگوسیتوز میگردد (فیشتی و همکاران، 2000; موری و همکاران، 2009).
کواگولاز به پروترومبین61 متصل میشود. این دو با هم فعالیت آنزیمی دارند و باعث تبدیل فیبرینوژن62 به فیبرین غیر کونژوگه63 میشوند و لخته تشکیل میشود. کواگولاز ممکن است رشتههای فیبرین را در سطح استافیلوکوکها انباشته کند در نتیجه از هضم آنها توسط سلولهای فاگوسیت کننده جلوگیری میکند. کواگولاز فاکتور نشان دهنده قدرت تهاجمی64 و پتانسیل بیماریزایی باکتری می باشد (بروکس و همکاران، 2010).
2-تست کاتالاز
این آنزیم موجب تسهیل در عمل تبدیل آب اکسیژنه سمی (H2O2 ) ناشی از متابولیسم به آب و اکسیژن میگردد و این آنزیم میتواند استافیلوکوکها را از اثر کشنده H2O2 که توسط ماکروفاژها تولید میشود محافظت کند (داس و بیشای، 2009).
3-تست DNase
این محیطیک محیط تفریق کننده است. در این آزمایش توانایی باکتری در تولید آنزیم DNase مشخص میشود )کوین و همکاران، 1994).
6-13-2- واکنش زنجیرهای پلیمراز65
1-اصول و مبانی PCR
واکنش زنجیرهای پلیمراز برای اولین بار توسط کری مولیس (دسامبر1983) توصیف گردید و به تدریج کاربردهای زیادی در بیولوژی مولکولی پیدا کرد (شاه حسینی و همکاران، 1380). امروزه PCR یکی از ابزارهای اساسی علوم بیولوژی است و کاربردهای بسیار فراوانی در حیطههای مختلف علوم بیولوژی مولکولی و به ویژه تشخیص بیماریهای عفونی پیدا کرده است.PCR بر اساس تکثیر قطعات DNA هدف توسط آنزیم مقاوم به گرما (مانند آنزیم پلی‌مراز Taq 66) و رشتههای کوتاه نوکلئوتیدی (پرایمر) میباشد (شاه حسینی و همکاران، 1380).
2-آمادهسازی نمونهها
در واکنش زنجیرهای پلیمراز مواد مختلفی مورد استفاده قرار میگیرد که هر کدام نقش منحصر بفردی در واکنش ایفا میکنند و نتیجه نهایی، حاصل استفاده صحیح از مجموعه این مواد میباشد که به شرح آنها پرداخته میشود (شاه حسینی و همکاران، 1380؛ کریمی و همکاران، 1383).
– DNA الگو:
کیفیت نمونه DNA، نتیجه نهایی PCR را به شدت تحت تاثیر قرار میدهد. مثلا حضور مقادیر زیاد RNA موجب جذب یون منیزیوم شده و بازده نهایی PCR را تحت الشعاع قرارمیدهد. نمونه ناخالص ممکن است حاوی عوامل مهارکننده پلی‌مراز باشد که موجب کاهش بازدهی واکنش میگردد. سالم بودن نمونه DNA نیز اهمیت فراوانی در نتیجه واکنش دارد به همین منظور میتوان برای کنترل کیفیت DNA آن را در ژل آگارز الکتروفورز کرد. اگر یک نمونه برای اولین بار در آزمون PCR مورد استفاده قرار میگیرد توصیه میشود یک نمونه مثبت که اندازه آن نیز مشخص است در کنار نمونهها مورد آزمایش قرار گیرد. میزان نمونه موجود در واکنش نیز در کارآیی PCR حائز اهمیت است (شاه حسینی و همکاران، 1380؛ کریمی و همکاران، 1383).
– پرایمر:
توالی و غلظت پرایمرها در واکنش تاثیر زیادی دارد. همچنین لازم است که نقطه ذوب دو پرایمر یکسان یا نزدیک به هم باشد. غلظت های 6/0-1/0 میکرومولار از پرایمر برای واکنش مطلوب میباشد، غلظتهای زیادتر پرایمر موجب تکثیر قطعات غیر اختصاصی شده و غلظتهای کم پرایمر باعث تمام شدن آن قبل از اتمام واکنش میشود و این موضوع نیز باعث کاهش مقدار محصول خواهد شد. مقدار مورد نیاز پرایمرمتناسب با مقدار DNA مصرف میشود که اغلب معادل یک میکروگرم به ازای 100 میکرولیتر مخلوطPCR میباشد (شاه حسینی و همکاران، 1380؛ کریمی و همکاران، 1383).
– آنزیمDNA پلیمراز:
متداولترین آنزیم برای PCRهای معمولی، DNA پلی‌مراز Taq است که معمولا بین 5/0 تا 5/2 واحد در 50 میکرولیتر مخلوط PCR استفاده میشود (شاه حسینی و همکاران، 1380؛ کریمی و همکاران، 1383).
– MgCl2:
یون منیزیوم با اتصال به dNTPها، مجموعه محلولی را ایجاد میکند که به عنوان سوبسترا یا آنزیم DNA پلیمراز عمل می‌کند. برای حصول بهترین نتیجه، غلظت نهایی MgCl2 را به شکل تجربی به دست میآورند. این غلظت برای واکنشهای PCR بین 1 تا 5/1 میلیمولار میتواند در نوسان باشد. متداولترین غلظت MgCl2 در واکنشها 5/1 میلیمولار (با غلظت 200 میکرومولار هر کدام از dNTP ها) میباشد. یون منیزیم فعالیت آنزیمی را تحت تاثیر قرار داده و افزایش آن باعث اتصال غیر اختصاصی پرایمرها به DNA الگو و ایجاد باندهای غیراختصاصی در واکنش میگردد (شاه حسینی و همکاران، 1380؛ کریمی و همکاران، 1383).
– dNTPs:
تنظیم مقدار متعادل هر چهار dNTP موجب کاهش اشتباه عمل آنزیم پلی‌مرازمیشود. اگر در واکنشی مجبور به افزایش مقدار dNTPs باشید بایستی مقدار MgCl2 نیز افزایش یابد. زیرا افزایش dNTPs موجب کاهش یون منیزیوم محلول شده و در نتیجه احتمال اتصال پرایمر به DNA هدف کاهش مییابد. مناسبترین غلظت dNTPs،200 میکرومولار در نظرگرفته میشود (شاه حسینی و همکاران، 1380؛ کریمی و همکاران، 1383).
– بافر:
جهت حفظ pH واکنش در محدوده مناسب استفاده میشود و انواع متنوعی دارد که بسته به شرایط و نوع PCR انتخاب میشوند (شاه حسینی و همکاران، 1380؛ کریمی و همکاران، 1383). در بین مواد ذکر شده که جهت انجام PCR لازم هستند فقط dNTPs و پرایمرها در واکنش مصرف میشوند، بنابراین غلظت بیشتر dNTPs سبب افزایش محصول و همچنین مقدار مناسب و حتی بیشتر پرایمر سبب اطمینان در اتصال پرایمر به تمامی نواحی مکمل خود روی DNA الگو میشود که این هم باعث افزایش محصول خواهدشد (شاه حسینی و همکاران،1380؛ کریمی و همکاران،1383؛ مدرس موسوی بهبهانی،1389).
3- چرخههای حرارتی
ابتدا یک مرحله واسرشت سازی جهت جهت جداسازی دو رشته DNA بمدت 5-3 دقیقه صورت میگیرد و سپس سه مرحله حرارتی به شرح زیر اعمال میشود:
1- واسرشت سازی67
این مرحله اولین مرحله معمول PCR بوده و شامل گرم کردن محیط به میزان 94 تا 98 درجه سانتیگراد به مدت 20 تا 30 ثانیه است. این عمل باعث ذوب شدن DNA (جدا شدن دو رشته DNA از همدیگر)، هم DNA الگو و همDNA پرایمر از طریق از بین رفتن باندهای هیدروژنی بین نوکلئوتیدهای دو رشته DNA و تولید DNA تک رشتهای میشود (شاه حسینی و همکاران، 1380؛ کریمی و همکاران، 1383).
2- اتصال68
در این مرحله دمای واکنش به 50 تا 65 درجه سانتیگراد به مدت 20 تا 40 ثانیه کاهش می یابد تا امکان اتصالDNA پلیمراز و پرایمر به DNA الگو که حالا تک رشته ای است فراهم شود. بطور معمول درجه حرارت اتصال حدود 3 تا 5 درجه سانتیگراد کمتر از دمای ذوب شدن پرایمر انتخاب میشود. مناسبترین اتصالDNA-DNA بین رشته الگو و پرایمر زمانی ایجاد میگردد که هر دو رشته در فاصله نزدیکی از هم قرار گیرند و هرچه توالی پرایمر با توالی رشته الگوی متناسبتر باشد این اتصال قویتر بوده و اتصال قوی جهت انجام عمل پلیمراز مورد نیاز است (شاه حسینی و همکاران، 1380؛ کریمی و همکاران، 1383).

3- بسط69
دمای این مرحله به نوع آنزیم DNA پلیمراز مورد استفاده و درجه حرارت مناسب مورد نیاز برای فعالیت آن بستگی دارد. بطور مثال آنزیم DNA پلیمراز Taq در درجه حرارت 75 تا 80 درجه سانتیگراد فعالیت قابل قبول داشته ولی بطور معمول از درجه حرارت 72 درجه سانتیگراد برای این آنزیم استفاده میشود. در این مرحله آنزیم DNA پلیمراز نوکلئوتیدهای مکمل را بر اساس رشته الگو از جهت 3َ- 5َ در کنار هم قرار داده و در نهایت رشته مکمل رشته الگوی اولیه را تولید میکند. مدت زمان این مرحله به نوع آنزیم DNA پلیمراز و طول رشتهDNA الگو بستگی دارد. در شرایط مساعد برای مثال اگر محدودیت سوبسترا وجود نداشته باشد در هر مرحله گسترش DNA دو برابر میشود (شاه حسینی و همکاران، 1380؛ کریمی و همکاران، 1383
4-آشکارسازی70 و تجزیه و تحلیل الگوی باندهای DNA
الکتروفورز ژل آگارز به عنوان روش معمول جهت جداسازی DNA و RNA در علوم بیوشیمی و بیولوژی مولکولی، کاربرد دارد. این روش بر مبنای حرکت مولکول های اسید نوکلئیکباردار منفی در بستر آگارز در حضور میدان الکتریکی ثابت (الکتروفورز) میباشد که متعاقب آن قطعات مولکول DNA بر حسب اندازهشان از یکدیگرتفکیک میگردند (شاه حسینی و همکاران، 1380؛ کریمی و همکاران، 1383).
5- ردیابی محصول PCR
جهت دیدن محصول PCR در ژل باید از آگارزهای استاندارد (DNA-grade) استفادهنمود. با این حال، آگارزهای با قدرت تفکیک بالا (مثلFMC Bioproducts Nusieve) توانایی جداسازی و مشاهده قطعات Kbp 2-bp 10 را دارند و جهت تفکیک بهتر محصولات کوچک PCR، میتوان از آنها استفاده نمود. برای محصولات کوچک از نظر اندازه، یا تفکیک بین محصولات کوچک و نزدیک از لحاظ اندازه، از ژل پلی آکریلامید استفاده می‏شود (شاه حسینی و همکاران،1380؛ کریمی و همکاران، 1383).
میتوان محصول PCR را در طی واکنش تکثیری (برای مثال با اضافهنمودن dNTPهای نشاندارشده به مواد رادیواکتیو یا فلورسنت یا بیوتین) نشاندار نمود. محصول سپس بوسیله الکتروفورز در ژل و در معرض قراردادن فیلم رادیولوژی و یا بوسیله آشکارسازی خاصیت فلورسنس و یا با استفاده از سیستم آشکارسازی اویدین/ استرپتاویدین شناسایی می‏گردد(شاه حسینی و همکاران، 1380؛ کریمی و همکاران، 1383).
تکثیر همزمان و آشکارکردن توالیهای DNA ویژه، بوسیله اضافه کردن رنگ هایی که با DNA واکنش میدهند مانند اتیدیوم بروماید در PCR، عملی می‏باشد. چون خاصیت فلورسنس اتیدیوم بروماید در حضور DNA دو رشته‏ای افزایش می‏یابد. همچنین علاوه بر کاربرد فوق میتوان از اتیدیوم بروماید جهت شناسایی محصول دورشته‏ای بعد از تکثیر نیز استفاده نمود (شاه حسینی و همکاران، 1380؛ کریمی و همکاران، 1383).
14-2- مروری بر تحقیقات انجام شده
تحقیق انجام شده توسط آرمین و همکاران (2007) روی 284 نفر (193 زن و 91 مرد) برای بررسی آلودگی به استافیلوکوکوس آرئوس صورت گرفت که در میان آنها 237 نفر (5/83 درصد) از کارگران بهداشت و درمان و 5 نفر دیابتی و 1 نفر دیالیزی بودند. استافیلوکوکوس آرئوسدر56 نفر(7/19 درصد) مشاهده شد که شامل 37 زن (2/19 درصد) و 19 مرد (7/20 درصد) بود. هیچ ارتباطی بین عفونت استافیلوکوکوس آرئوسی با جنس، سن و سال اشتغال مشاهده نشد. MRSA در 23 نفر (1/8 درصد) که شامل 16 مرد و 7 زن بود مشاهده شد.
تحقیق انجام شده توسط امین زاده و همکاران (2006) نشان میدهد که از 96 بیمار همودیالیزی، 44 نفر (45 درصد) حامل استافیلوکوکوس آرئوس در بینی خود بودند. همهی استافیلوکوکوس آرئوسهای جدا شده به متیسیلین مقاوم بودند، در حالی که 95 درصد به کلوکساسیلین، 81/6 درصد به کلیندامایسین، 81/6 درصد به سیپروفلوکساسین و 5/4 درصد به ریفامپین مقاوم بودند، با این حال همهی جدایهها به وانکومایسین حساس بودند.

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

در تحقیق رحیمی و همکاران (2009) نشان داده شد که از 558 نفر، 321 نفر (7/54 درصد) آلوده به استافیلوکوکوس آرئوس بودند که از این میان، 66، 65، 88، 88، 100، 41، 38، 41، 0، 40، 93، 20 و 64 درصد استافیلوکوکوس آرئوسها به کانامایسین، سفوتاکسیم، متیسیلین، اگزاسیلین، آمپیسیلین، اریترومایسین، کلیندامایسین، سولفامتوکسازول-تریمتوپریم، وانکومایسین، کلرامفنیکل، سیپروفلوکساسین، جنتامایسین و تتراسایکلین مقاوم بودند. همهی MRSA ها و 63 درصد از باکتریهای جدا شده حامل ژن mecA بودند.
در مطالعهی صادری و همکاران (2009) نشان داده شد که جدایههای MRSA، 49 درصد از همهی جدایهها بودند در حالی که تنها 7/1 درصد از جدایهها که حساس به متیسیلین (MSSA) بودند به چند دارو مقاوم بودند. نشان داده شد که همهی MRSAها به حداقل 5 آنتی بیوتیک مقاوم بودند. اکثر جدایهها از بیماران بالای 65 سال بودند. MRSA و شیوع آن بیشتر در میان استافیلوکوکوس آرئوسهای جدا شده از نمونههای تنفسی بود، همچنین شیوع MRSA در بخش مراقبتهای ویژه بیشتر از بخشهای دیگر بود.
فصل سوم
مواد و روش کار
مواد و روش کار
1-3- مواد و وسایل مورد نیاز
1-1-3- کشت باکتری
محیطهای کشت از جمله بلاد آگار، مانیتول سالت آگار، DNase آگار71، تریپتوز سوی براث72، مولر هینتون آگار73، اسکولین بایل سالت آگار74و مالتوز براث75 استفاده شد.
2-1-3- رنگ آمیزی گرم
جهت رنگ آمیزی گرم از محلول ها و معرف های کریستال ویوله76، محلول لوگول، الکل اتیلیک (اتانول)، رنگ سافرانین77 و استون استفاده شد.
3-1-3- بررسی مقاومت آنتیبیوتیکی
دیسکهای آنتیبیوتیکی پنی سیلین (10)، اریترومایسین (15)، تتراسایکلین (30)، جنتامایسین (10)، وانکومایسین (30)، آمپی سیلین (10)، ایمیپنم (10)، آموکسی سیلین (25)، سفتی زوکسیم (30)، متیسیلین (10) و اگزاسیلین (1) (padtan Teb co.) جهت بررسی مقاومت آنتیبیوتیکی استفاده شد.
4-1-3- استخراج DNA
– جهت استخراج DNA از کیت سینا ژن استفاده شد.
– جهت سانتریفیوژ کردن مواد از دستگاه اسپکترافیوژ78 شرکت لب نت79 استفاده شد.
5-1-4- PCR
موادPCR شامل: آب، بافر، پرایمر، منیزیم کلراید (MgCl2)، dNTPs، آنزیم Taq DNA polymerase، DNA و lader میباشد. جهت مشاهدهی محصول از تانک الکتروفورز، ژل آگاروز، اتیدیوم بروماید، بافر TAEو بافر بارگذاری استفاده شد، همچنین برای انجام آن از دستگاه ترموسایکر BIO – RAD استفاده شد.
2-3- روش کار
1-2-3- نمونه گیری
تعداد 80 نمونه از 4 منبع مختلف ورم پستان، مواد غذایی، عفونتهای انسانی و اسکناس انتخاب شد. این باکتریها قبلا برای پروژههای دیگری جدا شده و در کلکسیون بخش میکروب شناسی دانشکده دامپزشکی دانشگاه شیراز نگهداری میشدند.
2-2-3- کشت میکروبی
برای حصول اطمینان، تمام این جدایهها بر روی محیطهای کشت زیر و به روش معمول و براساس آزمایشهای مختلف بیوشیمیایی مورد تایید قرار گرفتند. برای این منظور آزمایشات زیر به ترتیب انجام شد:
– کشت روی محیط بلاد آگار و بررسی همولیز
– انجام رنگ آمیزی گرم
– انجام تست های کواگولاز، کاتالاز و اکسیداز
– کشت روی محیطهای مانیتول سالت آگار، DNase آگار، تریپتوز سوی براث، مولر هینتون آگار، اسکولین بایل سالت آگار و مالتوز براث
نتایج این آزمایشات رویاستافیلوکوکوس آرئوسهای جدا شده از منابع مختلف مواد غذایی، ورم پستان، اسکناس و عفونتهای انسانی صورت گرفته است، به صورت جداول 1-4، 2-4، 3-4 و 4-4 در فصل چهارم گزارش شده است.
نتایج مورد انتظار حاصل از آزمایشات فوق در جدول 1-3 گزارش شده است:
Biochemical Tests
CoagulaseCatalaseOxidaseHemolysisDNaseMannitol fermentationMaltose fermentationAesculin hydrolysisResults++-++++-جدول 1-3: نتایج مورد انتظار حاصل از آزمایشات نام برده
الف – آزمون کواگولاز
به روش اسلاید انجام گرفت:
یک قطره از پلاسمای خرگوش که با استفاده ازEDTA تهیه شده روی یک لام خشک و تمیز قرار داده میشد. یک قطره آب مقطر یا سرم فیزیولوژی در نقطه مجزائی به عنوان کنترل قرار داده میشد. بااستفاده از لوپ استریل مقداری از کلنی باکتری در هر یک از قطرات فوق به صورت سوسپانسیون مخلوط میشد. سپس از نظر تجمع باکتریها بررسی میشدند.
ب -آزمون کاتالاز
یک قطره از محلول 3% پراکسید هیدروژن را بر روی لام قرار داده و مقداری از باکتری در آن حل میشد. پیدایش حباب (در اثر آزاد شدن اکسیژن) بیانگر مثبت بودن آزمایش می باشد.
ج -آزمون اکسیداز
روی یک لام یک قطعه کاغذ صافی گذاشته، سپس محلول 1 درصد Tetramethyl-Phenylenediaminedihydrochloride روی آن ریخته و با استفاده از پیپت پاستور یک کلنی از باکتری برداشته میشد و روی کاغذ صافی پخش میشد. بعد از 15 ثانیه نتیجه تست قرائت میشد. در صورتی که این آنزیم در میکروارگانیزم وجود داشته باشد تحت تاثیر این آنزیم معرف به رنگ بنفش (آبی) ظاهر می شود.
3-2-3- آماده سازی محیطهای کشت
جهت آماده سازی محیط های کشت طبق دستور العملهای شرکت سازنده [(مرک آلمان و Antec Diagnostic (ATD)] به میزان مورد نیاز از پودر مورد نظر در مقدار مناسب آب مقطر حل میشد. محیط TSB به لولههای آزمایش انتقال مییافت. سپس محیطهای ساخته شده (بلاد آگار، مانیتول سالت آگار، مالتوز براث، DNase آگار، اسکولین بایل سالت آگار و TSB) در دمای 121 درجه سانتی گراد به مدت 15 دقیقه استریل میشدند. پس از استریل شدن و سرد شدن محیط های آگار تا دمای 40 تا 50 درجه سانتی گراد در دمای اتاق، این محیطها در زیر هود به پلیتهای استریل منتقل میشدند.
الف- کشت استافیلوکوکوس آرئوس روی محیط DNase آگار
یک کلنی از باکتریاستافیلوکوکوس آرئوس به صورت یک خط مستقیم روی محیط DNase آگار با لوپ کشت داده میشد ونتیجه بعد از 24 ساعت گرم خانهگذاری در دمای 37 درجه سانتیگراد قرائت میگردید.

دسته بندی : پایان نامه ارشد

پاسخ دهید